Avec les progrès conjoints des techniques de résolution structurale des molécules (radiocristallographie ou RMN) et des possibilités de calcul de modélisation moléculaire, la dernière décennie a vu croître de façon exponentielle le nombre de structures 3D résolues de protéines ou d'acides nucléiques (ADN, ARNt, ARNr,…). Malgré le retard des acides nucléiques sur les protéines (22 727 structures de Protéines-Peptides-Virus, 1 066 structures de complexes Protéine/Acides Nucléiques et 1 304 structures d'Acides Nucléiques enregistrées le 19 avril 2003 dans la Protein Data Bank), il est aujourd'hui établi que les acides nucléiques présentent une grande richesse de conformations alternatives à la fameuse double hélice d'ADN ou d'ARN. La plus importante parmi celles-ci est la structure dite en " épingle à cheveux ", dont les rôles fonctionnels et structuraux sont fondamentaux aux processus biologiques. Si l'accumulation de plus d'une centaine de ces structures a permis d'extraire certaines caractéristiques structurales de ces conformations et de mettre en place des familles structurales (sans cesse remodelées pour tenir compte des exceptions), à ce jour aucune théorie n'arrive à expliquer pourquoi ces molécules se structurent comme elles le font. Notre but est d'arriver à rationaliser et à quantifier simplement notre vision de ces structures à l'allure complexe.

Il est désormais habituel d'utiliser des rubans calculés a posteriori pour représenter sous forme simplifiée les structures résolues de polymères biologiques toujours plus gros. Nous (Jean Cognet, Christophe Pakleza et Guillaume Santini) venons de montrer, grâce aux développements conjoints d'une nouvelle approche (Biopolymer Chain Elasticity : BCE) et d'un logiciel de modélisation moléculaire (S-mol), que les squelettes sucre-phosphate de l'ADN et de l'ARN se comportent globalement comme des fils dans les structures en épingles à cheveux. Ces fils, i.e. les chaînes macromoléculaires tendues, adoptent un repliement tridimensionnel conforme aux trajectoires prédites par les lois de l'élasticité des barres minces. Les trajectoires des fils (représentés par des rubans) sont ainsi calculables a priori, et elles permettent de régénérer toute la structure atomique avec un nombre de degrés de liberté limité. A ce jour, la méthode BCE, initiée et développée par notre groupe, est sans doute la méthode de modélisation la plus adaptée pour étudier et comprendre ces motifs fondamentaux des acides nucléiques.

L'approche BCE est la nouvelle méthodologie de modélisation moléculaire des chaînes de biopolymères développée par notre équipe Elle permet de déformer hiérarchiquement les structures moléculaires. La trajectoire globale de la molécule est d'abord définie à l'échelle mésoscopique par la manipulation d'un fil élastique (représenté par un ruban). Le fil sert d'armature pour définir des opérations géométriques de déformation locale des structures atomiques qui préservent la structure globale de la molécule. La structure à l'échelle atomique est calculée dans une deuxième phase lors d'étapes d'optimisations.
Des constatations générales sur les structures résolues en tige-boucle sont à l'origine de notre étude :- La trajectoire de la chaîne simple-brin de la boucle est en continuité avec celle de la double-hélice, et adopte une forme globale caractéristique en "S", ou en "yin-yang".

• la plupart des valeurs des angles de torsion sont proches de celles de la double hélice,
• à l'exception de quelques angles de torsion au " sharp turn " qui suffisent à renverser la trajectoire.

BCE rend compte du comportement global et mécanique de ces chaînes de bio-polymères en considérant la chaîne sucre-phosphate du simple-brin d'ADN ou d'ARN comme un fil rigide, élément global de la structuration des boucles. Elle s'appuie sur la théorie de l'élasticité pour décrire et manipuler les chaînes simples brins d'acides nucléiques comme des barres minces.
Il important de noter que cette approche permet de simplifier énormément la description de la conformation de la molécule. La géométrie, en générale connue de l'hélice formant la tige de l'épingle à cheveux, suffit à définir (i.e. prédire) la trajectoire globale de la boucle. Aucun paramètre n'est donc nécessaire à ce point pour décrire la conformation de la boucle, alors que les formalismes atomiques nécessitent la connaissance d'au moins 6 valeurs d'angles de torsion par nucléotide (i.e. α, β, γ, δ ε et ζ) pour caractériser la trajectoire du squelette de la molécule. Déplacés par le repliement élastique de la chaîne sucre-phophate, certains atomes des bases de la boucle sont dans des conformations stériquement impossibles. La trajectoire (i.e. le fil) est utilisée (cf. figure infra) comme une armature pour faire tourner les nucléotides et résoudre ces problèmes d'encombrement. Ces rotations permettent l'optimisation fine de la position relative des atomes, pour converger vers des conformations qui s'accordent avec les données expérimentales.

1. Rotation des bases autour de la tangente au fil élastique : Angle Ω
   La première opération de déformation à l'échelle atomique découle du formalisme BCE. Il s'agit de la rotation d'angle Ω de chaque nucléotide autour de la tangente locale à la trajectoire élastique (cf. figure A ci-contre). Cette transformation géométrique admet un point neutre au niveau du ruban et déforme peu la géométrie des atomes du squelette de la molécule. Par contre, elle permet de grands déplacements des atomes des bases et permet de supprimer la plus grande partie des problèmes liés aux encombrements stériques. Cette opération propre à BCE introduit également 1 degré de liberté par nucléotide de la boucle.
2. Rotation des bases autour de la liaison glycosidique : Angle Χ
   La seconde opération de déformation à l'échelle atomique est la rotation d'angle de la base autour de la liaison sucre-base (cf. figure A ci-contre). Cette étape introduit 1 degré de liberté (i.e. 1 paramètre quantitatif de description de la conformation), par base de la boucle. Ce paramètre est utilisé dans les descriptions de conformations et lors des déformations uselles des acides nucléiques et n'est pas propre à BCE.
   
   
   
   
3. Redressement d'empilement des bases : Angle Θ
   Les deux transformations géométriques précédentes assurent à elles seules une grands déplacements des atomes des bases, mais ne suffisent pas toujours à produire des structures réalistes. Dans certains cas quelques atomes des bases extrémales de la boucle sont trop proches du dernier plateau de paire de bases de la tige. Le volume propre des atomes impose en effet une distance minimale de 3,34 Å entre deux bases empilées. Ce problème est résolu par l'introduction d'un dernier mode de déformation géométrique (cf. figure B ci-contre) qui consiste à redresser les bases au-dessus d'un plan d'exclusion par une rotation d'angle Θ.

L'introduction de l'élasticité pour modéliser la trajectoire de la chaîne sucre-phosphate prédit la structure globale du squelette d'une boucle d'épingle à cheveux. Ensuite, les 3 opérations géométriques que sont les rotations d'angle Ω, χ et Θ définies ci-dessus, procurent un jeu complet de 3 rotations pour déplacer et optimiser la position des atomes tout en préservant la structure globale.
Le formalisme de " construction-description " de l'approche BCE définit un jeu de paramètres descriptifs très simplifié de la conformation d'une structure. La nature quantitative des paramètres de description facilite énormément la comparaison des molécules de conformation et de composition différentes (séquence, ADN/ARN). En effet, ce jeux de paramètres est réduit à (Ω, χ, Θ)=3 paramètres par nucléotide de la boucle avec l'approche BCE, contre les (α, β, γ, δ, ε, ζ)=7 paramètres par nucléotide habituellement utilisés (pour les boucles de 3 nt que nous étudions le nombre de paramètres est ainsi réduit de 21 à 9).

Notre équipe a développé un logiciel (S-mol) qui calcule la structure repliée de molécules d'ADN ou d'ARN sur le principe BCE. Nous avons montré comment reconstruire les structures publiées de trois séquences d'ADN en épingles à cheveux sans mésappariement comportant une boucle TTT à partir des données RMN publiées. Nous avons reconstruit plusieurs boucles d'ADN ou d'ARN avec mésappariement à partir de structures publiées dans la PDB, soit total plus de 160 conformations unitaires :

• trois boucles à trois nucléotides d'ADN
  • 2 boucles GCA impliquées dans les maladies à triplets répétés
  • 1 boucle AAA pour l'utilisation du virus AAV2 en thérapie génique
• une boucle à quatre nucléotides (GTTA) d'ADN
• quatre boucles UUCG d'ARN publiées dans la PDB (UUCG fait partie du PIE (Polyadenylation Inhibition Element) qui lie le domaine RNP de la protéine humaine U1A. Il ferme l'hélice P1 des introns auto-excisables du groupe I. Il est rajouté pour ses propriétés de grande stabilité et pour l'étude de domaines de ribozymes)

Nous sommes parvenus à reconstruire, et donc à fournir une explication rationnelle pour toutes ces structures d'ADN ou d'ARN en épingle à cheveux résolues expérimentalement par RMN, et/ou disponibles dans la PDB. Ces résultats montrent sans ambiguïté que ces structures peuvent être reconstruites à partir de la déformation élastique d'une hélice d'ADN ou d'ARNvii,viii. Ces premiers résultats très encourageants montrent que notre approche BCE :

1. décrit au moyen d'une théorie conceptuellement simple (déformation continue d'un simple brin hélicoïdal) et d'un nombre réduit de paramètres conformationnels la structure des boucles de chaînes d'acides nucléiques.
2. met en évidence une caractéristique d'élasticité mécanique des squelettes de courtes chaînes d'AN.
3. peut prédire ab initio la trajectoire du squelette de certaines boucles de bio-polymères,
4. unifie le cadre théorique de modélisation et de description des boucles d'ADN et d'ARN. Les différences structurales entre ces classes de molécules proviennent principalement de la différence de géométrie des hélices qui les supportent (hélice en forme B pour l'ADN et en forme A pour l'ARN).

Les angles de torsion du squelette sucre-phosphate des boucles d'AN (α, β, γ, δ ε et ζ) sont connus pour être proches des valeurs observées dans les structures en double hélice. A l'exception de la zone appelée sharp-turn où a lieu l'inversion de la trajectoire de la boucle pour joindre les deux extrémités de la tige, ces angles sont quasiment identiques. Nous avons montré que le repliement élastique d'une chaîne en hélice sur une trajectoire élastique (continuité du fil de la boucle avec les fils de l'hélice), permet de conserver ces angles de torsion sans déviation importante.

Les fonctions structurales et biologiques des épingles à cheveux d'AN sont grandement conditionnées par leur stabilité thermodynamique. Beaucoup de boucles d'intérêt biologique connues pour leur hyperstabilité (Tm entre 55° et plus de 90°), présentent des mésappariements dans la boucle. Leur étude est cruciale pour comprendre les phénomènes de structuration et d'interaction des molécules d'ADN et d'ARN et les fonctions biologiques qu'elles remplissent.
Deux bases mésappariées sont liées par une ou plusieurs liaisons hydrogènes. Elles sont mésappariées lorsque l'appariement n'est pas de type Watson-Crick canonique (A-T ou G-C). Leur étude exhaustive est expérimentalement très difficile, le coût en temps (RMN+modélisation) et financier étant élevé. Pour ces raisons, il est utile de mettre en place une technique de modélisation facilitant leur exploration. De ce point de vue, BCE s'est révélée être une approche particulièrement bien adaptée. Par son approche hiérarchique de la modélisation des boucles (on traite d'abord mésoscopiquement la forme globale de la boucle, puis à l'échelle atomique, l'optimisation et la recherche de liaisons hydrogènes) et par la rapidité de ses calculs, il est possible d'explorer l'ensemble des appariements envisageables pour les tri-boucles d'ADN. Ceci est réalisé par le couplage d'une fonction d'analyse de la présence de liaisons hydrogènes à l'exploration des espaces conformationnels des boucles (en fonction de Ω, Θ et χ) qui produit des cartes de contour où apparaissent les conformations appariées (cf. figure infra).




Ces résultats sont très bons, car on considère habituellement que la résolution de la technique expérimentale (la RMN) est de l'ordre de 1 Å. Ce travail a permis de montrer que BCE est capable de prédire ab initio la structure complète de toutes les tri-boucles d'ADN publiées présentant un mésappariement à 1, 2 ou 3 angles de torsion près, sans introduction de données expérimentales. En introduisant les angles de torsion manquant, les RMSd calculés entre les structures BCE et publiées sont en moyenne de 1 Å à l'échelle de la structure globale et de 0,7 Å à l'échelle des structures locales. L'obtention de ces résultat a demandé des développements logiciels notables afin de prendre en compte les nouveaux degrés de liberté de déformation des molécules, notament les rotations nécessaire au redressement d'empilement des bases de la boucle sur les plateaux de la tige. D'autre part il a fallu développer une procédure d'exploration automatique des espaces conformationnels en tenant compte des différentes conformations possibles pour les bases des appariements, des différents type de bases qui pouvent être impliquées. Il a finalement développer des procédures de traitement et de mise en forme automatique des données (cf. figures supra) de façon a faciliter leur analyse et de rendre possible et interprétables les résultats obtenus.

La nouvelle approche de modélisation moléculaire basée sur l'élasticité des biopolymères que nous développons au laboratoire, permet de simplifier et de comparer des structures très différentes par leur séquence et leur nature (ADN/ARN). Elle prédit la structure de nombreuses boucles d'AN publiées (ADN : 3-4 bases dans la boucle= TTT, GCA, GAA, ATC, AGC, GAC, GTTA ; ARN : 4 bases dans la boucle= UUCG) au moyen d'un nombre limité de paramètres. Elle prédit la trajectoire de la chaîne sucre-phosphate. Elle offre un cadre théorique très adapté pour explorer toutes les boucles non encore résolues.

Les enjeux sont considérables. La compréhension de la double hélice d'ADN et de ses propriétés structurales a permis d'interpréter et d'expliquer des interactions moléculaires impliquées dans les processus de régulation de l'expression génique. La compréhension des structures en boucle, devrait permettre de répondre sur le plan fondamental à un nombre aussi grand de questions biologiques et pathologiques, notamment en expliquant les liens entre la séquence, la structure et les fonctions. À terme cette recherche fondamentale devrait permettre d'orienter la conception de molécules modifiées pour agir sur des fonctions biologiques spécifiques.

G.P.H. Santini, J.A.H. Cognet, D. Xu, K.K. Singarapu and C. Hervé du Penhoat (2009). "Nucleic acid folding determined by mesoscale modeling and NMR spectroscopy: solution structure of d(GCGAAAGC)". J. Phys. Chem. B, in press.
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C. Pakleza and J. A. H. Cognet (2003), "Bipolymer Chain Elasticity: a novel concept and a least deformation energy principle predicts backbone and overall folding of DNA TTT hairpins in agreement with NMR distances". Nucleic Acids Research, 31, 1075-1085.- Fichier PDF -

G. P. H. Santini, C. Pakleza and J. A. H. Cognet (2003), "DNA tri- and tetra-Loops and RNA tetra-Loops hairpins fold as Elastic Biopolymer Chains in agreement with PDB". Nucleic Acids Research, 31, 1086-1096.- Fichier PDF -

"Méthodologies du Repliement de l'ADN à différentes échelles : 1/ Modélisation moléculaire des épingles à cheveux à partir de la théorie de l'élasticité et de contraintes RMN, 2/ Analyse et mesure de la courbure et de la flexibilité à partir de microscopies"
Thèse de Doctorat de l'Université Pierre et Marie Curie -Paris VI-

"Vers la prédiction de la structure tridimensionnelle des épingles à cheveux d'ADN et d'ARN comportant un appariement dans la boucle à partir de la théorie de l'élasticité et de la mécanique moléculaire"
Thèse de Doctorat de l'Université Pierre et Marie Curie -Paris VI- - Fichier PDF -